Preparazione del campione in linea (ILSP) Revive: Un approccio più rapido per l’analisi multiresiduale dei pesticidi negli alimenti

• La purificazione in linea e automatizzata dell’estratto del campione riduce drasticamente il tempo necessario alla preparazione dei campioni.
• L’analisi simultanea e il lavaggio della cartuccia ILSP eliminano i tempi di inattività fra un campione e l’altro.
• Un’alternativa rapida e semplice ai metodi QuEChERS o SPE per l’analisi multiresiduale di pesticidi negli alimenti.

La preparazione del campione in linea (in-line sample preparation, ILSP) è una tecnica di preparazione del campione ideale per i laboratori di sicurezza alimentare che cercano di risparmiare tempo e denaro dedicati a ogni campione LC-MS/MS, senza per questo sacrificare le prestazioni. Una cartuccia per pesticidi ILSP Revive separa gli analiti dai componenti della matrice potenzialmente interferenti proprio come accade con i metodi tradizionali SPE e QuEChERS, ma consente di evitare lunghe procedure manuali grazie a un processo di purificazione automatizzata che avviene nello strumento in linea con il flusso del campione analitico. Sfruttando efficaci meccanismi di ritenzione (per esempio, interazioni a fase inversa) e l’efficiente configurazione delle particelle, le cartucce per pesticidi ILSP Revive forniscono una purificazione cromatografica potente e automatizzata di campioni complessi, che avviene sullo strumento contemporaneamente all’analisi dei campioni.

Un esempio dei vantaggi della preparazione del campione in linea è illustrato nella Figura 1, che mostra un confronto tra un flusso di lavoro ILSP Revive per i pesticidi e un flusso di lavoro tipico QuEChERS per l’analisi dei residui di pesticidi negli spinaci. L’approccio ILSP ha reso possibile un risparmio di tempo di un’ora e mezzo, con un numero inferiore di trasferimenti di campioni, offrendo così un aumento significativo della produttività della preparazione dei campioni. Inoltre, il metodo ILSP riduce al minimo il rischio di introdurre errori attraverso fasi manuali e fornisce risultati analitici equivalenti o superiori a quelli del metodo QuEChERS. Uno studio esaustivo sul confronto tra questi due metodi è stato pubblicato da Lupo, et al. [1].

Come funziona la Preparazione del campione in linea Revive?

Come illustrato nella Figura 2, ILSP Revive incorpora una cartuccia di purificazione dei campioni direttamente nel flusso di iniezione LC. Una volta che gli analiti raggiungono la colonna analitica, la cartuccia di purificazione ILSP viene sottoposta a controlavaggio, o “rigenerata”, per prepararla per la successiva iniezione mentre viene analizzato il primo campione. È possibile effettuare l’analisi e la rigenerazione contemporaneamente grazie a una valvola a sei porte e a una pompa isocratica indipendente standard. Le indicazioni dettagliate per la configurazione dello strumento, l’impostazione dei parametri del metodo (per esempio, fasatura delle valvole e velocità di flusso dei solventi di risciacquo) e l’individuazione di un efficace solvente di risciacquo sono riportate nel documento contenente le linee guida di Restek intitolato Sviluppo del metodo di preparazione del campione in linea. Il risparmio quotidiano dei costi operativi ripagherà velocemente l’investimento in una pompa e il tempo impiegato per il set-up del metodo, soprattutto in caso di laboratori con un elevato numero di campioni o con risorse limitate per la preparazione dei campioni.

Risultati costanti ed economicamente vantaggiosi e durata maggiore

Oltre al risparmio di tempo, ILSP offre risultati costanti e un sostanziale contenimento dei costi. Ne è un esempio eccellente un esperimento di lunga durata condotto utilizzando 300 iniezioni di estratti di avocado. L’avocado, un prodotto ad alta percentuale di grassi, è stato fortificato con una gamma esemplificativa di 61 pesticidi con caratteristiche chimiche e tempi di ritenzione diversi. I campioni sono stati poi estratti e analizzati utilizzando il flusso di lavoro ottimizzato rappresentato nella Figura 3. Il metodo di preparazione del campione in linea è stato significativamente più veloce rispetto a un analogo flusso di lavoro QuEChERS per gli avocado, e con una singola cartuccia per pesticidi ILSP Revive si sono ottenuti una purificazione efficace e risultati cromatografici costanti per tutta la durata dell’esperimento.

I tre pesticidi evidenziati nella Figura 4 rappresentano composti a eluizione rapida, media e tardiva inclusi nella lista completa degli analiti. Tempi di ritenzione, forme del picco e risposte costanti per centinaia di iniezioni di matrice dimostrano l’efficacia della purificazione effettuata con la cartuccia per pesticidi ILSP Revive. Dei 61 pesticidi monitorati, il 95% soddisfa i criteri stabiliti dalle linee guida SANTE/12682/2019 emanate dai Laboratori di riferimento dell’Unione Europea (recupero 70-120%, %RSD ≤ 20%), se valutati come serie di iniezioni in triplicato di un singolo estratto [2].

Oltre a una maggiore velocità e a prestazioni solide, ILSP offre un significativo risparmio di costi. Per esempio, considerando un costo di 4 dollari per ciascun campione QuEChERS (pacchetto di sali di estrazione e provetta dSPE), i 300 campioni di avocado avrebbero comportato una spesa di 1200 dollari solo in prodotti QuEChERS. Il flusso di lavoro di preparazione del campione in linea Revive usa una semplice estrazione liquido-solido senza estrazione di sali né dSPE, eliminando i relativi costi. Con una singola cartuccia per pesticidi ILSP Revive, che costa circa un quarto del prezzo totale dei prodotti QuEChERS, è stato possibile purificare efficacemente 300 campioni di avocado, e siccome la prestazione non è calata dopo 300 iniezioni non è stato necessario sostituire la cartuccia una volta concluso l’esperimento.

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
1.	Imidacloprid	2.678	50	256.1	175.0	209.0
2.	Fenhexamid	4.557	50	302.1	97.1	55.05
3.	Eprinomectin	6.396	50	914.6	186.1	154.1

Column	Raptor ARC-18 (cat.# 9314A12)
Dimensions:	100 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Guard Column:	Raptor ARC-18 EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9314A0252)
Temp.:	50 °C
Standard/Sample
Diluent:	Acetonitrile, 0.1% acetic acid
Inj. Vol.:	3 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.2% formic acid, 2 mM ammonium formate
B:	Methanol, 0.2% formic acid, 2 mM ammonium formate
C:	Methanol, 0.2% formic acid, 10 mM ammonium formate
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.4 95 5 2 0.4 40 60 4 0.4 25 75 6 0.4 0 100 8 0.4 0 100 8.01 0.4 95 5 10 0.4 95 5

Detector	MS/MS
Ion Source:	Electrospray
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	Sample Fortification and Extraction Avocado was peeled and homogenized, and 5 g of sample was weighed into a 50 mL polypropylene tube. 10 mL of acetonitrile containing 0.1% acetic acid was added to the sample and vortexed. Samples were shaken on a shaker table for 10 minutes and then centrifuged at 4200 rpm for 10 minutes. An aliquot was transferred to a vial and fortified with analytes for a final concentration of 50 ng/g. The sample was vortexed, and an aliquot transferred to a 0.2 μm PTFE Thomson filter vial cat.# 25893 and filtered prior to injection. In-Line Sample Preparation (ILSP) The UHPLC system was equipped with an auxiliary pump; 6-port, high-pressure switching valve; and dual-directional 5 x 2.1 mm Revive ILSP Pesticides cartridge and holder (cat.# 27882). At 5.5 min, after the target compounds had all eluted from the ILSP cartridge and were undergoing analysis, valve switching was used as described below to flush the ILSP cartridge and wash trapped matrix components to waste. At 7.0 min, the original valve configuration, where the ILSP cartridge is in-line with the analytical column, was restored and the system was brought back to equilibrium prior to the next injection. • 0 min; valve position 0 • 0 min; C flow= 0 mL/min • 5.49 min; C flow= 0 mL/min • 5.5 min; valve position 1 • 5.5 min; C flow= 1 mL/min • 6.9 min; C flow=1 mL/min • 7 min; C flow= 0 mL/min • 7 min; valve position 0
Notes	Thomson SINGLE StEP standard filter vials cat.# 25893 were used to produce this chromatogram, but have since been discontinued. For assistance choosing a replacement for this application, contact Restek Technical Service or your local Restek representative.

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ILSP Revive in azione: analisi multiresiduale dei pesticidi in vari alimenti

L’analisi dei pesticidi nei prodotti alimentari è un’operazione particolarmente complessa a causa della vasta gamma di chimiche degli analiti e di tipi di matrice (ricco di grassi, ricco di zuccheri, altamente pigmentato, povero di acqua, ecc.). Per affrontare questa difficoltà, è stata elaborata una serie di prodotti QuEChERS che garantiscono estrazione e purificazione efficaci in diverse situazioni. Tuttavia, una singola cartuccia per pesticidi ILSP Revive può fornire risultati eccellenti nella stessa vasta gamma di analiti e matrici. 

Per dimostrare questa ampia applicabilità è stato condotto uno studio di recupero impiegando i metodi di preparazione del campione in linea sviluppati per sei prodotti appartenenti a cinque gruppi di prodotti contemplati nelle linee guida SANTE/12682/2019 (Tabella 1). Questi alimenti sono stati fortificati con 61 pesticidi rappresentativi di una gamma di composti chimici con diversi tempi di eluizione (rapido, medio, tardivo) in un cromatogramma con metodo tipico di screening multiresiduale dei pesticidi (Tabella II).

Tabella I: Prodotti utilizzati per sviluppare i metodi ILSP Revive.

Tabella II: Gli esperimenti di recupero con ILSP Revive sono stati condotti utilizzando 61 pesticidi diversi sia per caratteristiche chimiche che per tempo di eluizione (rapido, medio, tardivo) in metodi tipici di screening multiresiduale dei pesticidi.

Estrazione di campioni ILSP

Per l’estrazione ILSP Revive, l'omogeneizzazione dei campioni seguita da un’estrazione liquido-solido ha funzionato bene per tutti i prodotti in esame. I parametri esatti dell’estrazione (solvente, volume, tempo di agitazione, filtrazione, ecc.) sono stati ottimizzati per ogni prodotto, ma la procedura complessiva è stata semplice, veloce ed efficace: omogeneizzazione, aggiunta del solvente, agitazione, seguiti se necessario dalla filtrazione del campione. Inoltre, i metodi di preparazione del campione in linea riducono la perdita di analiti durante la purificazione, in quanto non avviene la fase dispersiva di purificazione tipica dei metodi QuEChERS.

Il recupero della ILSP nei vari gruppi di prodotto

Quasi tutti i pesticidi in esame sono stati recuperati da tutte le sei diverse matrici entro le linee guida prestazionali SANTE/12682/2019, tramite LC-MS/MS con intervallo di sensibilità medio-basso (Tabella III). Tali risultati dimostrano l’ampia applicabilità della preparazione del campione in linea Revive per il monitoraggio multiresiduale dei pesticidi nei prodotti alimentari per il consumo umano e animale.
Inoltre, nel confronto con metodi analoghi QuEChERS, ILSP Revive ha ottenuto prestazioni affini, quando non superiori, in tutti i casi in esame. Per esempio, qualora i composti non rientrino nell’intervallo di recupero ideale del 70-120%, le linee guida SANTE/12682/2019 dispongono di riportare quei dati se i risultati sono coerenti, come accade con la purificazione riproducibile e automatica ILSP.

Tabella III: Prestazioni di recupero totale per i metodi ILSP Revive sviluppata per sei prodotti alimentari differenti.

Gli effetti della matrice e la ILSP

Come in qualsiasi analisi di campioni reali, è probabile che alcuni componenti della matrice vengano estratti insieme agli analiti target. Sotto questo aspetto, il metodo ILSP non è diverso da qualsiasi altra tecnica di preparazione dei campioni e il miglior modo per garantire una quantificazione accurata è quello di usare standard di calibrazione accoppiati alla matrice. Ciò vale in particolare per i composti che eluiscono all’inizio della corsa, dove è più probabile che compaiano i componenti della matrice non trattenuti, causando potenziamento o soppressione.

Oltre a influire sulla quantificazione, i componenti della matrice possono contaminare la strumentazione. Utilizzando i metodi di preparazione del campione in linea, si iniettano estratti non purificati, perciò è importante effettuare il lavaggio esterno e interno dell’ago tra un’iniezione e l’altra. In questo modo si evita sia il carryover tra un campione e l’altro sia la formazione di incrostazioni, la cui rimozione potrebbe determinare tempi di inattività dello strumento.

Preparazione del campione in linea Revive: un approccio più rapido per l’analisi multiresiduale dei pesticidi negli alimenti

La preparazione del campione in linea mette a frutto le potenzialità del vostro LC-MS/MS per sveltire e automatizzare la purificazione degli estratti dei campioni. La cartuccia ILSP Revive per pesticidi, la valvola a sei porte e la pompa isocratica indipendente sono in grado di trasformare il vostro strumento in un’arma vincente del vostro laboratorio, unendo l’analisi e la purificazione del campione in un unico metodo efficiente. Inserire la ILSP Revive nei vostri attuali metodi per l’analisi multiresiduale di pesticidi negli alimenti vi permetterà di diminuire il tempo di preparazione dei campioni, ridurre i costi dei prodotti monouso e limitare gli errori derivanti dalle procedure manuali.

References

1. S.A. Lupo, R.L. Romesberg, X. Lu, Automated inline pigment removal for the analysis of pesticide residues in spinach by liquid chromatography tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1629 (2020) 461477. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461477
2. EU Reference Laboratories for Residues of Pesticides, SANTE/2019/12682, Analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed (2020). https://www.eurl-pesticides.eu/userfiles/file/EurlALL/AqcGuidance_SANTE_2019_12682.pdf