Revive In-Line Sample Preparation (ILSP) : Une approche plus rapide pour l’analyse multi-résidus de pesticides dans les aliments

• La purification en ligne et automatisée des échantillons réduit considérablement leur temps de préparation.
• Le nettoyage de la cartouche ILSP se fait pendant l’analyse, ce qui permet d’enchaîner les échantillons très rapidement.
• Alternative simple et rapide aux techniques QuEChERS ou SPE pour l’analyse multi-résidus de pesticides dans les aliments.

La préparation d’échantillons en ligne ILSP est une technique de préparation d’échantillons idéale pour les laboratoires de sécurité alimentaire qui cherchent à économiser du temps et de l’argent sur leurs analyses LC-MS/MS sans sacrifier les performances. Une cartouche Revive ILSP Pesticides sépare les analytes d’intérêt des interférences matricielles potentielles, comme le font les méthodes traditionnelles SPE et QuEChERS, mais elle remplace les procédures manuelles fastidieuses par un processus automatisé et en ligne de purification puis d’analyse de l’échantillon. Grâce à l’efficacité de leurs mécanismes de rétention (par exemple des interactions de phase inverse) et de la conception spécifique de leurs particules, les cartouches Revive ILSP Pesticides promettent une purification chromatographique efficace et automatisée d’échantillons complexes ayant lieu en même temps que l’analyse de ces échantillons.

Afin de démontrer les avantages d’une préparation en ligne, la Figure 1 compare une procédure utilisant la technologie Revive ILSP à une procédure QuEChERS typique pour l’analyse de résidus de pesticides dans les épinards. L’approche ILSP a permis d’économiser 1,5h avec moins de transfert d’échantillons, ce qui a donc entraîné une augmentation significative de la productivité en termes de préparation d’échantillons. La technologie ILSP diminue également le risque d’erreurs manuelles et fournit des résultats analytiques équivalents ou supérieurs aux techniques QuEChERS. Une étude exhaustive de cette comparaison a été publiée par Lupo et al. [1].

Préparation d’échantillons en ligne Revive : comment ça marche ?

Comme le montre la Figure 2, la technologie Revive ILSP intègre une cartouche de purification de l’échantillon directement dans le circuit d’injection LC. Une fois que les analytes ont atteint la colonne analytique, la cartouche de purification ILSP est alors rincée ("revived") par "backflush" et remise en condition pour l’analyse suivante pendant que le premier échantillon est quant à lui analysé. Ces régénération et analyse simultanées sont rendues possibles grâce à l’utilisation d’une vanne 6 voies et d’une pompe isocratique standard indépendante. Notre article à propos du développement des méthodes ILSP vous fournira tous les conseils nécessaires et détaillés sur la configuration de l’instrument, le réglage des paramètres de la méthode (par exemple la synchronisation de la vanne ou le débit de solvant utilisé pour le rinçage de la cartouche) ou encore comment identifier le solvant de rinçage le plus approprié. Les économies quotidiennes réalisées sur les coûts d’exploitation compenseront très rapidement l’investissement dans une pompe standard et le temps passé à configurer la méthode, en particulier pour les laboratoires ayant un nombre élevé d’échantillons à analyser ou pour ceux ayant des ressources limitées au niveau de la préparation des échantillons.

Des résultats répétables et reproductifs, des analyses plus rentables et de plus longues durées de vie

Au-delà du gain de temps, une expérience menée sur la durée de vie des cartouches avec 300 injections d’extraits d’avocat fournit un excellent exemple de la constance des résultats et des économies substantielles qu’offre la technologie ILSP. L’avocat, un produit riche en matières grasses, a été dopé avec un mélange représentatif de 61 pesticides ayant des caractéristiques chimiques et des temps de rétention différents. Les échantillons ont ensuite été extraits et analysés en suivant la procédure optimisée illustrée dans la Figure 3. La méthode de préparation en ligne des échantillons était significativement plus rapide que la procédure QuEChERS comparable, et une seule et unique cartouche Revive ILSP Pesticides a pu fournir une purification efficace et des résultats chromatographiques constants et cohérents tout au long de la durée de l’expérience.

Les trois pesticides mis en avant dans la Figure 4 sont représentatifs des composés ayant une faible rétention, une rétention moyenne et une forte rétention. La stabilité des temps de rétention, des formes de pics et des réponses, sur plusieurs centaines d’injections de matrice, démontre la robustesse de la purification des cartouches Revive ILSP Pesticides. Sur les 61 pesticides analysés sous forme d’une série de triple injection d’un seul extrait [2], 95% d’entre eux ont satisfait aux critères de performance établis par les directives SANTE/12682/2019 des Laboratoires de Référence de l’Union Européenne (EURL) – rendements entre 70 et 120% et %RSD ≤ 20%.

En plus des gains en vitesse et des performances robustes, la technologie ILSP permet également une réduction des coûts assez significative. Par exemple, si nous supposons que le coût d’un échantillon traité par la technique QuEChERS (sachet de sels d’extraction et tube dSPE) coûte environ 4$, alors les 300 échantillons d’avocat seraient revenus à 1200 $ rien qu'en produits QuEChERS. La procédure de la préparation en ligne Revive utilise une simple extraction liquide-solide, sans sels d’extraction ou de dSPE, ce qui élimine donc le coût lié à ces produits. Une seule et unique cartouche Revive ILSP Pesticides a pu purifier efficacement les 300 échantillons d’avocat, tout en maintenant ses performances et sans avoir à la changer avant la fin de l’expérience, et ce pour un coût quatre fois moindre qu'en utilisant la technique QuEChERS.

	Peaks	tR (min)	Conc. (ng/g)	Precursor Ion	Product Ion 1	Product Ion 2
1.	Imidacloprid	2.678	50	256.1	175.0	209.0
2.	Fenhexamid	4.557	50	302.1	97.1	55.05
3.	Eprinomectin	6.396	50	914.6	186.1	154.1

Column	Raptor ARC-18 (cat.# 9314A12)
Dimensions:	100 mm x 2.1 mm ID
Particle Size:	2.7 µm
Pore Size:	90 Å
Guard Column:	Raptor ARC-18 EXP guard column cartridge 5 mm, 2.1 mm ID, 2.7 µm (cat.# 9314A0252)
Temp.:	50 °C
Standard/Sample
Diluent:	Acetonitrile, 0.1% acetic acid
Inj. Vol.:	3 µL
Mobile Phase
A:	Water, 0.2% formic acid, 2 mM ammonium formate
B:	Methanol, 0.2% formic acid, 2 mM ammonium formate
C:	Methanol, 0.2% formic acid, 10 mM ammonium formate
	Time (min) Flow (mL/min) %A %B 0.00 0.4 95 5 2 0.4 40 60 4 0.4 25 75 6 0.4 0 100 8 0.4 0 100 8.01 0.4 95 5 10 0.4 95 5

Detector	MS/MS
Ion Source:	Electrospray
Ion Mode:	ESI+
Mode:	MRM
Instrument	UHPLC
Sample Preparation	Sample Fortification and Extraction Avocado was peeled and homogenized, and 5 g of sample was weighed into a 50 mL polypropylene tube. 10 mL of acetonitrile containing 0.1% acetic acid was added to the sample and vortexed. Samples were shaken on a shaker table for 10 minutes and then centrifuged at 4200 rpm for 10 minutes. An aliquot was transferred to a vial and fortified with analytes for a final concentration of 50 ng/g. The sample was vortexed, and an aliquot transferred to a 0.2 μm PTFE Thomson filter vial cat.# 25893 and filtered prior to injection. In-Line Sample Preparation (ILSP) The UHPLC system was equipped with an auxiliary pump; 6-port, high-pressure switching valve; and dual-directional 5 x 2.1 mm Revive ILSP Pesticides cartridge and holder (cat.# 27882). At 5.5 min, after the target compounds had all eluted from the ILSP cartridge and were undergoing analysis, valve switching was used as described below to flush the ILSP cartridge and wash trapped matrix components to waste. At 7.0 min, the original valve configuration, where the ILSP cartridge is in-line with the analytical column, was restored and the system was brought back to equilibrium prior to the next injection. • 0 min; valve position 0 • 0 min; C flow= 0 mL/min • 5.49 min; C flow= 0 mL/min • 5.5 min; valve position 1 • 5.5 min; C flow= 1 mL/min • 6.9 min; C flow=1 mL/min • 7 min; C flow= 0 mL/min • 7 min; valve position 0
Notes	Thomson SINGLE StEP standard filter vials cat.# 25893 were used to produce this chromatogram, but have since been discontinued. For assistance choosing a replacement for this application, contact Restek Technical Service or your local Restek representative.

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Revive ILSP : Analyse multi-résidus de pesticides dans différents aliments

L’analyse de pesticides dans les denrées alimentaires est particulièrement complexe de par la grande variété des structures chimiques des analytes mais aussi de par la grande diversité des types de matrices (riches en graisses, riches en sucres, riches en pigments, à faible teneur en eau, etc.). Pour tenter de résoudre ces problèmes, de nombreux produits QuEChERS ont été développés et formulés pour assurer une extraction et une purification efficaces dans ces différentes situations. Ici, une seule et unique cartouche Revive ILSP Pesticides peut fournir d’excellents résultats sur la même large gamme d’analytes et de matrices. 

Pour démontrer cette large gamme d’application de la technologie ILSP, une étude de rendement a été menée sur six aliments couvrant 5 des groupes d’aliments décrits dans les directives SANTE/12682/2019 (Tableau I). Ces aliments ont été dopés avec 61 pesticides représentatifs des différentes chimies des composés et éluant à différents temps de rétention (précoces, moyens, tardifs) sur un chromatogramme typique d’un screening multi-résidus de pesticides (Tableau II).

Tableau I : Aliments utilisés pour développer les méthodes Revive ILSP.

Tableau II : Les études de rendements sur les cartouches Revive ILSP ont été menées en utilisant 61 pesticides qui différaient à la fois en termes de caractéristiques chimiques  et en termes de temps de rétention (précoces, moyens, tardifs) dans les méthodes typiques de screening multi-résidus de pesticides.

Extraction ILSP

Pour la partie extraction, une homogénéisation de l’échantillon suivie d’une extraction liquide-solide ont bien fonctionné pour les matrices alimentaires étudiées. Les paramètres d’extraction (solvant, volume, temps d’agitation, filtration, etc.) ont été optimisés pour chaque matrice, mais la procédure globale reste simple, rapide et efficace : homogénéisation, ajout d’un solvant, agitation et filtration de l’échantillon si nécessaire. Et comme il n’y a pas d’étape de purification par SPE dispersive comme c’est le cas avec les méthodes QuEChERS, les méthodes ILSP minimisent le risque de perte d’analyte pendant la purification.      

Rendements ILSP pour divers produits alimentaires

Quasiment tous les pesticides étudiés ont été récupérés et retrouvés dans les six différentes matrices, dans les critères de performance décrits par les directives SANTE/12682/2019, en utilisant une chaîne LC-MS/MS de sensibilité faible à moyenne (Tableau III). Ces résultats démontrent l’énorme potentiel de la préparation d’échantillons en ligne Revive pour l’analyse multi-résidus de pesticides dans les denrées alimentaires et les aliments pour animaux.

De plus, lorsque la technologie Revive ILSP a été comparée à des méthodes QuEChERS analogues, l’ILSP a donné des résultats à minima comparables sinon meilleurs, dans tous les cas étudiés. Et dans les cas où certains composés tombent hors de la gamme idéale de rendement de 70-120%, les directives telles que SANTE/12682/2019 prévoient des dispositions pour rapporter ces données, si les résultats sont robustes et répétables comme c’est le cas avec la purification automatisée et reproductible ILSP.

Tableau III : Rendements et performance des méthodes Revive ILSP développées pour six produits alimentaires différents.

Effets de matrice & ILSP

Comme pour toute analyse d’échantillons réels, certains composés de la matrice peuvent être extraits avec les analytes cibles. A cet égard, l’ILSP n’est pas différente des autres techniques de préparation d’échantillons et l’utilisation de standards de calibration adaptés à la matrice ("matrix-matched") est le meilleur moyen de s’assurer de quantifications précises. Ceci est d’autant plus vrai pour les composés éluant au début de l’analyse là où les composés de la matrice non ou peu retenus sont les plus susceptibles d’apparaître et de causer un gain ou une perte de signal.      

En plus d’affecter la quantification, les composés interférents provenant de la matrice peuvent également contaminer les instruments. Dans les méthodes de préparation d’échantillons en ligne, l’échantillon injecté est non purifié, il est donc important de s’assurer que des rinçages internes et externes de l’aiguille sont effectués entre chaque injection pour éviter la contamination entre échantillons et empêcher l’accumulation des composés qui pourrait entraîner des temps d’arrêt machine pour "nettoyage".

Préparation d’échantillons en ligne Revive : une approche plus rapide pour l’analyse multi-résidus de pesticides dans les aliments

La préparation d’échantillons en ligne ILSP utilise la puissance de vos chaînes LC-MS/MS pour automatiser la purification des échantillons. Avec une cartouche Revive ILSP Pesticides, une vanne 6 voies, et une pompe isocratique indépendante, votre instrument peut être transformé en un outil analytique ultra-performant, combinant la purification de l’échantillon et son analyse en une seule et même méthode efficace. En intégrant Revive ILSP dans vos méthodes actuelles d’analyse multi-résidus de pesticides dans les aliments, vous réduirez le temps de préparation de vos échantillons, vous réduirez vos coûts associés aux produits de préparation d’échantillons à usage unique et vous réduirez les erreurs potentielles liées aux procédures manuelles.

Références

1. A. Lupo, R.L. Romesberg, X. Lu, Automated inline pigment removal for the analysis of pesticide residues in spinach by liquid chromatography tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1629 (2020) 461477. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.461477
2. EU Reference Laboratories for Residues of Pesticides, SANTE/2019/12682, Analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed (2020). https://www.eurl-pesticides.eu/userfiles/file/EurlALL/AqcGuidance_SANTE_2019_12682.pdf